"Città batteriche" e architettura molecolare: nuove tecniche di indagine microscopica

3-D reconstruction  of the bacterial biofilm
made by cholera bacteria. (Veysel Berk image)

Che le colonie batteriche possano essere dei precursori degli organismi complessi può anche essere, intanto agli scienziati interessa conoscere come i batteri formano le loro colonie, per combatterli più efficacemente. Osservarli meglio è un modo per scoprire i loro segreti ed è quello che hanno fatto all'Università di Berkeley dove il Nobel per la Fisica Steven Chu e i suoi collaboratori [S. Chu et al. 2012] dicono di aver sviluppato una tecnica  microscopica che permette di vedere più finemente la struttura di queste colonie. Si è  notato, per esempio, che prima di cominciare a dividersi i batteri producono una proteina, una specie di colla per ancorarsi alla superficie, dopo  cominciano a replicarsi e formano una matrice extracellulare che cementa i tre diversi tipi di organizzazione batterica, cellule, ammassi di cellule e collezioni di ammassi e infine creano un guscio protettivo. 

A questo scopo hanno utilizzato una colonia di Vibrio cholerae, per cercare di capire in che modo i microrganismi realizzano quelle strutture chiamate biofilm, spesso così resistenti all'azione degli antibiotici e che rendono le malattie infettive a volte piuttosto tenaci da combattere. La tecnica utilizzata è la super resolution microscopy che permette di ottenere definizioni 10 volte maggiori della microscopia ottica convenzionale, 20 nm contro 200 nm e lo fa -con le parole di Veysel Berk, biologo con formazione fisica coautore dello studio-

by highlighting only part of the image at a time using photo-switchable probes and compiling thousands of images into a single snapshot. The process is much like painting with light – shining a flashlight beam on a dark scene while leaving the camera shutter open. Each snapshot may take a few minutes to compile, but for slow cellular growth, that’s quick enough to obtain a stop-action movie.

 mettendo in evidenza solo una parte dell'immagine alla volta utilizzando sonde foto-commutabili e la compilazione di migliaia di immagini in una sola istantanea. Il processo è molto simile a dipingere con la luce - proiettare un fascio di luce  su una scena buia, lasciando aperto l'otturatore della fotocamera. Ogni istantanea può richiedere alcuni minuti per essere compilata, ma  a causa della lenta crescita cellulare è abbastanza veloce per ottenere uno stop-action movie.

Uno dei problemi per ottenere una sequenza continua è come mantenere la colorazione fluorescente durante la crescita della colonia. Di solito si usa una tecnica che serve per produrre istantanee e non un film: si uniscono anticorpi primari alle cellule batteriche poi li si irradia con un pigmento fluorescente legato all'anticorpo secondario; si lava via l'eccesso di pigmento non unito ai due anticorpi legati, si invia un fascio di luce e si fotografa la fluorescenza. Come detto, però, questa tecnica pone dei seri limiti alla ripresa continua. Uno di questi è l'eccesso di pigmento che di solito si usa e che poi deve essere eliminato per evitare interferenze. Ma c'è una concentrazione di pigmento critica che permette la fluorescenza ma non causa il rumore di fondo che inquinerebbe il risultato:

“The classical approach is first staining, then destaining, then taking only a single snapshot,” Berk said. “We found a way to do staining and keep all the fluorescent probes inside the solution while we do the imaging, so we can continuously monitor everything, starting from a single cell all the way to a mature biofilm. Instead of one snapshot, we are recording a whole movie.”

"L'approccio classico è prima la colorazione, poi la decolorazione, e poi prendere  una singola istantanea", ha detto Berk. "Abbiamo trovato un modo per fare la colorazione e mantenere tutte le sonde fluorescenti all'interno della soluzione  mentre catturiamo le immagini, in modo da poter monitorare costantemente tutto, a partire da una singola cellula fino ad un biofilm completo. Invece di un'istantanea, stiamo registrando un film intero. "

Il risultato è quello che potete vedere qui sotto.

Nel filmato i colori rappresentano: RbmA (grigio, proteina con funzioni di cemento tra cellule), RbmC (rosso, proteina che forma un guscio protettivo), Bap1 (verde, proteina che serve come collante per aderire alla struttura) e le cellule batteriche (blu). 

Nei Supplementary materials sono disponibili altri filmati in cui si vede come i ceppi di V. cholerae mancanti di qualche proteina presentino una struttura della matrice extracellulare più debole.

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Veysel Berk, Jiunn C. N. Fong, Graham T. Dempsey, Omer N. Develioglu, Xiaowei Zhuang, Jan Liphardt, Fitnat H. Yildiz, and Steven Chu, Molecular Architecture and Assembly Principles of Vibrio cholerae Biofilms, Science 13 July 2012: 337 (6091), 236-239. [DOI:10.1126/science.1222981]



imagecredit  vcresearch.berkeley.edu